医院是各种病人聚集的地方，也是各种病原微生物滋生的地方，所以，医院环境的消毒也是一项非常重要的工作。
一般情况下，凡是没有被传染病病人接触过的医院环境，包括多数设备，只需彻底清洗，无需消毒。但当遭受血液、体液污染或感染性疾病病人接触过时，需用含有效氯0.5%～1%的消毒剂消毒；另外，营养室、配餐室的桌面、免疫力低下病人或易感病人的环境清洁消毒也可用含氯消毒剂。
用物理、化学以及生物的方法，使室内空气的含菌量尽量减少到无尘无菌状态，常采用湿式清扫、定时通风换气和紫外线空气消毒等措施。若遇传染或严重感染性疾病病人出院可采用过氧乙酸喷雾或熏蒸进行消毒。近年来，一些手术室、骨髓移植室以及无菌药物制剂室等室内的空气，均采用生物净化法使室内空气达到绝对净化。
一般被服均经洗涤后高温消毒。对特殊感染所污染的被服最理想的灭菌方法是用环氧乙烷气体素蒸灭菌。各科病人的被服可集中起来，先送环氧乙烷消毒间灭菌后，再送洗衣房清洗备用。
工作人员的手，一般情况下，用肥皂和流水清洗可去除表面一过性的污染菌。但如接触过被致病菌污染的人或物后，不但要用肥皂和流水冲洗，还要用碘伏或其他灭菌液浸泡消毒。外科手术野和注射部位的皮肤宜先用2%~2.5%碘酊消毒一遍，20秒后再用75%酒精脱碘两遍的消毒方法或选用碘伏消毒两追的方法。粘膜的消毒可根据不同的部位选择不同的消毒剂。
医疗器械以及其他物品是治疗和检查必不可少的用具，直接接触病人的粘膜、创口等，所以是导致医院感染的重要途径，必须进行严格的清洁、消毒、灭菌处理。消毒方法以压力蒸汽灭菌法最为可靠。但对不耐高温高压的塑料、玻璃及锐利的手术刀、剪等可用化学消毒剂浸泡消毒灭菌。
凡穿透皮肤、粘膜进入无菌组织的器材，均需严格灭菌，并首选压力蒸汽灭菌；如外科手术器材、心导管、导尿管、针头等，这类器材被任何致病微生物污染，都有引发严重感染的危险。凡接触病人粘膜及有破损皮肤的器材，如呼吸机近端、麻醉机近端、内窥镜、口腔器械等，必须进行灭菌和高水平的消毒处理，可选用热消毒或性能良好的化学消毒剂，如环氧乙烷、2%戊二醛等。
由于完整的皮肤对多数微生物有屏障作用，所以对一些只与完整皮肤接触的物品，如体温计、便盆、血压计袖带、床头柜等，不需灭菌处理，只需清洗干净或选用低效消毒剂浸泡消毒即可。