一、PCR实验室的清洁消毒
(1)PCR实验室应设置试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物和扩增区及扩增产物分析区4个工作区城,4个区域必须是相互独立的,不能直通,应有缓冲间供工作人员换工作服和鞋,并且有明确的标志,进入各工作区域严格按照从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物和扩增区→扩增产物分析区单一方向进行。
(2)各区有完善的相应设备,仪器设备和所有物品必须严格分开,不得混用,不同的工作区域使用不同颜色的工作服.工作人员离开时不得将工作服帶出。在整个PCR实验操作过程中,工作人员都必须戴上手套,并经常更换,还要求工作人员戴口罩,避免在处理样本时对人体造成污染,保证工作人员的身体安全。每次实验前应作好吸嘴Eppendorf管、反应管和加样器等物品的高压消毒,各工作区域的地面用10%次氯酸钠消毒,打开排风扇使各区的空气流通。
(3)试剂贮存和准备区:贮存试剂的制备、试剂分装和主反应混合液的制备都应在该区完成。贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过产物分析区。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。贮存试剂溶液经检查可用后,应将其分装贮存备用避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。目前本科室使用的试剂盒反应液是厂家配好的,单人单管只需从此区移至下一个工作区域。工作结東后必须立即对工作区域进行清洁消毒,实验室的桌椅表面每次工作后也要清洁,实验室的空气消毒打开房项的紫外灯照射。
(4)标本制备区:标本处理对核酸扩增有很大影响,必须使用有效的提取方法,选择好的试剂品牌是一个很关键的问题,试剂质量的好坏直接影响到实验结果的准确性。临床标本都集中在本区,实验操作过程中一定要严格按照实验室操作流程,特别在加样中,空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶污染,所以应避免在本区内不必要的走动,为避免样本间的交叉污染,加入待测核酸后,必须盖好含反应混合液的反应管,防止溶液外溅。工作结束后必须立即对实验台表面、加样器、有机玻璃试管架,离心机,首先用10%次氯酸钠消毒,然后用70%乙醇清洁,另外,实验台表面使用254nm波长可移动紫外灯,距离实验台上60~90 cm内长时间照射照射过夜更好。用过的吸嘴必须放人专用的含次氯酸钠溶液的容器内浸泡,实验室的桌椅表面每次工作后也要清洁,实验室的空气消毒同样打开房顶的紫外灯照射。
(5)扩增区:DNA扩增不能从本区再进人任何“上游”区城,以避免气溶胶从本区漏出,本区是最主要的扩增产物污染来源,因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。本区工作后的清洁消毒和紫外灯照射方法与前面区域相同。
二、PCR实验室的防污染措施
(1)污染原因:①扩增产物污染:这是 PCR反应中最主要也是最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大,远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以,极微量的PCR产物污染,就可造成假阳性。实验材料如重组克隆的DNA或者来自同一次PCR的扩增产物污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样器,容器及其他溶液被PCR核酸模板污染。②测试样品污染:收集标本的容器被污染或标本放置时由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于加样器污染导致标本间污染;尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。③气溶胶污染:最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较刷烈地摇动反应管开盖时、吸样时及污染加样器的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48 000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。另外,实验室的环境、试剂及任何与扩增产物接触的东西,都是污染的来源。
(2)防污染措施:PCR 实验室严格分区:将实验室分为4个工作区域并严格按照从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物和扩增区→扩增产物分析区单一方向顺序进行。各区必须相互独立,仪器设备和各种物品严格分开,不能串用。分装PCR试剂:当使用的PCR试剂盒,不是独立分装的反应液时,应将PCR反应液预先配制好。然后分装到反应管-20℃保存,以减少重复加样次数,避免污染机会。PCR试剂、PCR反应液与样品及PCR产物分开保存,试剂盒电面的阳性对照、阳性参考品也应该与试剂分开放置,不应放于同一冰箱。正确使用加样器:吸样时要特别小心应缓慢匀速,避免液体溅到加样器头上,尽量一次性吸完,忌反复多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶。打出液体后拇指不应松开按钮,将吸嘴压掉后冉将拇指松开,避免液体回吸。实验前后按要求作好实验室的清洁消毒工作,特别是实验完成后,消毒工作一定要彻底,破坏残留的DNA防止操作人员污染,使用一次性手套,吸嘴、Eppendorf管和反应管也应该一次性使用。Eppendorf管的质量也不容忽视,好质量的(有齿轮)Eppendorf管,管盖密封严实,避免样本外溢和外来核酸的进入。打开之前应先离心,将管壁和管盖上的液体甩至管底开盖时动作要轻以防管内液体溅出,造成污染。应设阳性对照和阴性对照,选择拷贝在临界值的弱阳性作阳性对照,并注意交叉污染的可能性,每次实验都应有一管不加模板的试剂对照,以监测试剂是否污染,还应带一个不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
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